13006微生物遺傳學(xué)第八章自考復(fù)習(xí)資料

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        第八章 工業(yè)微生物雜交育種

        第一節(jié) 雜交育種原理

        一、基因重組：將兩個(gè)不同形狀個(gè)體內(nèi)的基因轉(zhuǎn)移到一起，經(jīng)過重新組合，形成新的遺傳型個(gè)體的過程稱為基因重組。

        二、雜交育種微生物傳遞的途徑

        1、通過雙親細(xì)胞的融合，涉及到整套染色體的基因重組，如真核微生物的有性生殖、準(zhǔn)性生殖。（酵母菌雜交、霉菌的雜交）

        2、通過雙親細(xì)胞的溝通，涉及到部分染色體的基因重組，如原核微生物的接合，（F因子傳導(dǎo)）

        3、雙親細(xì)胞不接觸，僅個(gè)別少數(shù)基因的重組，如原核微生物的轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化。（噬菌體感染）

        三、雜交育種

        一個(gè)菌種長(zhǎng)時(shí)間使用誘變劑處理后，其生活能力逐漸下降，如生長(zhǎng)周期延長(zhǎng)、孢子減少、代謝減慢、產(chǎn)量增加緩慢等。故雜交育種就成為菌種選育的另一重要手段，雜交是細(xì)胞水平的概念，而基因重組是分子水平的概念。

        已知供體、受體親本。雜交育種更具在方向性，但方法復(fù)雜、進(jìn)度慢，篩選工作大，應(yīng)用不廣。

        四、雜交育種的目的

        1、改變親株的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)，擴(kuò)大變異范圍，使兩親株的優(yōu)良性狀集中于重組體內(nèi)，獲得新品種；

        2、克服因長(zhǎng)期誘變?cè)斐傻纳盍ο陆怠⒋x緩慢等缺陷，也可以提高對(duì)誘變劑的敏感性，降低對(duì)誘變劑的“疲勞”效應(yīng)。

        3、使不同菌株的遺傳物質(zhì)進(jìn)行交換和重新組合，從而改變?cè)芯甑倪z傳物質(zhì)基礎(chǔ)，獲得雜交株。

        4、分析雜交結(jié)果，可以總結(jié)遺傳物質(zhì)的住那一和傳遞規(guī)律，豐富并促進(jìn)遺傳學(xué)理論的發(fā)展。

        五、微生物雜交育種基本程序

        選擇原始親本→ 誘變篩選直接親本→直接親本之間親和力鑒定→雜交→分離到基本培養(yǎng)基或選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)→篩選重組體→重組體分析鑒定。

        六、雜交育種使用的材料

        1、出發(fā)菌株 2、培養(yǎng)基 3、器皿 4、直接親本（標(biāo)記菌）

        第二節(jié) 原核微生物的雜交育種

        一、細(xì)菌雜交育種（重點(diǎn)）

        （一）接合是指兩個(gè)性別不同的微生物細(xì)胞之間接觸，遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移、交換、重組，形成一個(gè)新個(gè)體。（指通過供體菌和受體菌的完整細(xì)胞的直接接觸，傳遞大片的DNA（包括質(zhì)粒）遺傳信息的的現(xiàn)象。

        （二）致育因子

        細(xì)菌的雜交關(guān)鍵是性因子，即F因子。F因子是一種質(zhì)粒，它存在于細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)中，一般為游離狀態(tài)，有時(shí)和染色體以結(jié)合態(tài)存在，是一種穩(wěn)定的遺傳物質(zhì)。

        1、F+菌株：具備F性因子的細(xì)胞稱為有性因子菌株（F+），即“雄性”菌株，為供體菌。其F因子獨(dú)立存在，細(xì)胞表面有性菌毛。又稱為低頻重組菌種。

        2、F-菌株：不具備F性因子的細(xì)胞稱為無性因子菌株（F-），即“雌性”菌株，為受體菌。無有性菌毛，可通過接合作用接收F因子變成F+.

        3、Hfr菌株：有時(shí)供體菌的F因子可以整合到細(xì)胞染色體DNA上，這樣使F+菌株成為高度致育細(xì)胞，稱為Hfr菌株，這類菌株的特點(diǎn)是不僅細(xì)胞內(nèi)很有F因子，而且F因子的DNA嵌入染色體的DNA中。轉(zhuǎn)移染色體基因的能力很高，重組頻率大，又稱高頻重組菌株。其細(xì)菌表面有性菌毛。

        4、F‘菌株：Hfr菌株內(nèi)的F因子因不正常切割而脫離染色體，形成游離的但攜帶一小段染色體基因的F因子稱為F’因子。含有這種性因子的菌株就稱為F‘菌株，又稱低頻重組菌株。

        F因子轉(zhuǎn)導(dǎo)：當(dāng)F‘細(xì)胞與F-細(xì)胞接合時(shí)，把所攜帶的供體菌部分染色體基因也同時(shí)轉(zhuǎn)移到F-細(xì)胞中去，使受體菌株遺傳性狀發(fā)生改變而獲得重組體，這個(gè)過程稱為F因子轉(zhuǎn)導(dǎo)。

        （三）雜交過程  詳見書P259

        1、F-*F+雜交——重組頻率低

        （1）F+細(xì)菌通過性毛與F-細(xì)菌接觸并發(fā)生相互作用；

        （2）F+細(xì)菌的F因子出現(xiàn)缺口，雙鏈之一被切斷，從斷端轉(zhuǎn)移F因子的一條鏈到F-細(xì)菌中；

        （3）F因子的一條鏈進(jìn)入F-細(xì)菌中，在F-細(xì)菌中復(fù)制新的F因子；

        （4）復(fù)制完成后，F(xiàn)-細(xì)菌變成了F+細(xì)菌，同時(shí)原有F+細(xì)菌也完成了F因子的復(fù)制。

        2、Hfr*F-雜交——雜交最好組合

        雜交過程：當(dāng)Hfr菌株與F-菌株接觸，細(xì)胞壁溝通，Hfr細(xì)胞染色體單鏈打開，遠(yuǎn)離F因子一端的染色體DNA先進(jìn)入F-細(xì)胞內(nèi)，F(xiàn)因子到最后才轉(zhuǎn)入或不轉(zhuǎn)入到F-菌株中，待進(jìn)入F-菌株細(xì)胞的一段供體染色體和受體染色體結(jié)合形成部分合子，經(jīng)過雙交換或兩次單交換，Hfr菌株的一段染色體整合到F-菌株細(xì)胞的環(huán)狀染色體中，形成具有一定新遺傳性狀的重組體菌株。

        中斷雜交實(shí)驗(yàn)——如果在兩個(gè)配對(duì)菌株拉倒過程中，每隔一定時(shí)間以強(qiáng)烈攪拌中斷接合，結(jié)果導(dǎo)致Hfr菌株轉(zhuǎn)移到F-菌株中染色體節(jié)段的斷裂位置不一，由此造成進(jìn)入受體細(xì)胞具在Hfr性狀的基因數(shù)量和種類不同，從而可獲得多樣化類型的重組體，稱為中斷雜交實(shí)驗(yàn)。

        （四）細(xì)菌雜交方法與技術(shù)P262

        1、雜交親本菌株，根據(jù)實(shí)驗(yàn)選擇不同遺傳特性的兩親本菌株，并且要還一定選擇性標(biāo)記和非選擇性標(biāo)記。

        2、標(biāo)記菌株，最常用的標(biāo)記為營(yíng)養(yǎng)缺陷。

        3、性別菌株的獲得：F+菌株，F(xiàn)+菌株與F-菌株接合并把F因子轉(zhuǎn)移到F-菌株中，從而使F-菌株轉(zhuǎn)變?yōu)镕+菌株；F-菌株，把F+菌株用不足以抑制其生長(zhǎng)的低濃度吖啶橙處理即可得F-菌株；Hfr菌株，通過F+菌株和F-菌株雜交獲得。

        4、雜交方法，細(xì)菌雜交一般采用直接混合法（詳見P262）：將兩個(gè)直接親本菌株分別培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，再將Hrf菌株和F-菌株細(xì)胞以1：10或1：20的比例混合，水浴振蕩，菌株細(xì)胞接合，親本菌株間的染色體進(jìn)行連接、交換和重組，然后稀釋涂布在基本培養(yǎng)基上或其他選擇性培養(yǎng)基上篩選得到各種重級(jí)菌株或其他雜交后代。

        二、放線菌的雜交育種（重點(diǎn)）

        （一）放線菌雜交原理：通過供體向受體轉(zhuǎn)移部分染色體，經(jīng)過遺傳物質(zhì)交換，最終達(dá)到基因重組。雜交原理相似于細(xì)菌，雜交方法相似于霉菌。放線菌的雜交只發(fā)生在具有一定感受態(tài)菌株之間。P265

        1、異核現(xiàn)象：有些放線菌的營(yíng)養(yǎng)缺陷型在混合培養(yǎng)或雜交過程中，經(jīng)菌絲和菌絲間的接觸和融合而形成異核體。

        2、接合現(xiàn)行：菌絲間接觸和融合后，相同細(xì)胞質(zhì)里把不同基因型的細(xì)胞核在雙方增殖過程中，發(fā)生部分染色體的轉(zhuǎn)移或遺傳信息的交換，接合現(xiàn)象導(dǎo)致部分合子的形成。

        3、雜合系的形成：部分合子形成后，在繁殖復(fù)制過程中，兩種不同基因型的染色體進(jìn)行一次交換，產(chǎn)生雜合系。雜合系是由基質(zhì)菌絲中長(zhǎng)出來的，形成的菌落很小，能在選擇性培養(yǎng)基和基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。

        4、重組體的形成：以上檢出的雜合系或重組雜合系，在以后進(jìn)一步繁殖過程中，雜合狀態(tài)染色體的不同區(qū)段還要進(jìn)行幾次交換。根據(jù)交換的位置不同，所攜帶的基因種類、數(shù)量也不一致，形成了一系列基因型的環(huán)狀染色體細(xì)胞，從產(chǎn)生的菌落中可檢出不同類型重組分離子。雜合系是形成重組體所必須的階段。

        （二）放線菌雜交過程（示意圖見P266）

        親本→局部結(jié)合子（部分合子）→雜合系→重組體

        1、部分結(jié)合子是由一個(gè)供體細(xì)胞的部分染色體和一個(gè)受體細(xì)胞整套染色體相結(jié)合，同時(shí)存在于一個(gè)細(xì)胞質(zhì)中，也有時(shí)兩個(gè)親本細(xì)胞的染色體都是以部分染色體進(jìn)行結(jié)合。兩個(gè)親本細(xì)胞以全部染色體進(jìn)行結(jié)合形成的異核體在復(fù)制過程中染色體不發(fā)生交換，所產(chǎn)生的分生孢子進(jìn)一步培養(yǎng)又獲得兩親本。

        2、部分合子形成后，在繁殖復(fù)制過程中，兩種不同基因型的染色體進(jìn)行一次交換，產(chǎn)生了雜合系。雜合系是由基質(zhì)菌絲中長(zhǎng)出的，形成的菌落很小，能在選擇性培養(yǎng)基和基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。

        3、雜合系不是封閉的環(huán)狀結(jié)構(gòu)而是呈線狀，經(jīng)過進(jìn)一步繁殖，形成一系列基因型的環(huán)狀染色體細(xì)胞，從而形成重組體。

        （三）放線菌的雜交技術(shù)   圖示P267

        放線菌雜交方法有混合培養(yǎng)法、雜核系分析法、玻璃紙法和平板雜交法等。

        一、混合培養(yǎng)法：

        （1） 直接親本是雜交配對(duì)菌株，要求攜帶不同的營(yíng)養(yǎng)缺陷型或抗性作為遺傳標(biāo)記。

        （2） 斜面混合接種（CM），即取兩親標(biāo)新培養(yǎng)的成熟孢子或菌絲，重迭接種到完全培養(yǎng)基斜面。

        （3） 單孢子的制備，即制單孢子懸液。

        （4） 重組體的檢出：用選擇性平板分離得到目的重組體。

        二、雜合系分析法：圖示P270

        從混合培養(yǎng)的孢子懸液中，分離篩選雜合系，再進(jìn)一步從雜合第中篩選各種分離子。

        兩親本混合培養(yǎng)→孢子懸液→MM培養(yǎng)基培養(yǎng)→取雜合系菌落（較小的）上的孢子制成單孢子懸液→CM培養(yǎng)基上培養(yǎng)→點(diǎn)種→影印到多種不同的選擇性培養(yǎng)基平板上→得到所需要的重組體

        三、玻璃紙法：

        兩親本都具有營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記，且對(duì)同一藥物一個(gè)敏感，另一個(gè)具有抗性。

        兩親本孢子混合，接種到覆蓋于CM培養(yǎng)基的玻璃紙表面，經(jīng)一定時(shí)間培養(yǎng)，將玻璃紙轉(zhuǎn)移到含有藥物的SM培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到惟獨(dú)能生長(zhǎng)的特定雜合系菌叢。

        四、平板雜交法：將CM上培養(yǎng)的A親本菌落孢子影印至在CM（或有限培養(yǎng)基）上培養(yǎng)的B親本菌落平板上，培養(yǎng)一段時(shí)間，兩親本菌絲接合形成部分合子，染色體進(jìn)行單交換后形成雜合系，然后影印其孢子到各種選擇性培養(yǎng)基平板上，從中可檢出重組體分離子。

        注：有限培養(yǎng)基（LM）是由CM和MM以1：9組成。

        三、轉(zhuǎn)導(dǎo)（了解）

        定義：借助溫和噬菌體為媒介，把供體細(xì)胞中DNA片段攜帶到受體細(xì)胞中，從而使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)。  獲得新遺傳性狀的受體細(xì)胞稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)子。  轉(zhuǎn)導(dǎo)過程不需要接觸，而是以噬菌體為載體。

        （一） 普通（普遍）傳導(dǎo)：媒介為完全缺陷噬菌體（侵染后其DNA為供體細(xì)胞的）

        （二） 局限傳導(dǎo)：媒介為部分缺陷噬菌體（侵染后其部分DNA為供體細(xì)胞的）

        四、轉(zhuǎn)化（了解）

        轉(zhuǎn)化是受體菌直接吸收環(huán)境中供體菌的DNA片段而獲得后者部分遺傳性狀的現(xiàn)象。

        轉(zhuǎn)化因子：起轉(zhuǎn)化作用的供體細(xì)胞的DNA片段；轉(zhuǎn)化子：通過轉(zhuǎn)化作用形成的受體細(xì)胞。

        特點(diǎn)：1. 一般只發(fā)生在同一物種或近緣物種之間；2.受體細(xì)胞只有處于感受態(tài)階段才能吸收供體的DNA.

        感受態(tài)：指細(xì)胞能從周圍環(huán)境吸收DNA分子，將其整合入自己的基因組，并保證不被體內(nèi)DNA酶破壞的生理狀態(tài)，即實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)。

        轉(zhuǎn)化育種條件：1、感受態(tài)的出現(xiàn)（a受體細(xì)胞的遺傳，b生理狀態(tài)，c菌齡，d培養(yǎng)條件）；2、供體DNA濃度（實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化所需的DNA濃度極低）；3、DNA相對(duì)分子質(zhì)量（一般為10*-7，約含有50個(gè)基因，太短則不能轉(zhuǎn)化）；4、感受態(tài)因子（它是一種胞外蛋白）。

        第三節(jié) 真核微生物的雜交育種

        一、有性雜交：不同遺傳型微生物的性細(xì)胞（單細(xì)胞）發(fā)生接合和重組的現(xiàn)象。

        準(zhǔn)性雜交：不同遺傳型微生物體細(xì)胞的核融合而導(dǎo)致的一種低頻率基因重組現(xiàn)象（親緣關(guān)系很近的親本）。

        二、霉菌的雜交育種P277

        （一）霉菌的準(zhǔn)性生殖

        兩親本→準(zhǔn)性接合→基因重組→新遺傳型→菌絲聯(lián)結(jié)→質(zhì)配→核配→有絲分裂→單倍子

        準(zhǔn)性生殖和有性生殖的區(qū)別；   準(zhǔn)性生殖                有性生殖

        參與接合的親本細(xì)胞            形態(tài)相同的體細(xì)胞    形態(tài)、生理上存在分化的性細(xì)胞

        獨(dú)立生活的異核階段                有                       無

        接合后雙倍體細(xì)胞形態(tài)           與單倍體相同             與單倍體不同

        雙倍體變成單倍體的途徑          有絲分裂                  減數(shù)分裂

        頻率                         偶然 、低                正常出現(xiàn)、高

        （二）準(zhǔn)性生殖的三個(gè)階段：

        在菌絲體生長(zhǎng)過程中，不同遺傳類型的菌絲細(xì)胞接觸融合，形成異核體、雜交二倍體，最后經(jīng)染色體相互交換，產(chǎn)生一個(gè)具有新遺傳特性的菌株。

        異核體的形成（不穩(wěn)定）→雜合雙倍體的形成（穩(wěn)定）→體細(xì)胞交換和單元化（單倍體化）

        異核體：具有不同性狀的兩菌株的菌絲互相連接，導(dǎo)致在一個(gè)細(xì)胞或一條菌絲中并存有兩種或兩種以上不同遺傳型的細(xì)胞核，進(jìn)行質(zhì)配，兩個(gè)不同基因型的核獨(dú)立存在，這樣的菌絲體稱為異核體。（可參照P279的定義）。異核體屬于不穩(wěn)定菌株，它們所產(chǎn)生的分生孢子會(huì)分離成兩種親本型，不能在MM上生長(zhǎng)。

        雜合雙倍體的形成：異核細(xì)胞不夠穩(wěn)定，異核體中不同基因型的兩個(gè)核有少數(shù)可發(fā)生細(xì)胞融合，進(jìn)行核配，形成二倍體核，其存在較穩(wěn)定。采用天然樟腦蒸氣熏蒸或紫外線照射異核體，可以誘發(fā)異核體形成雜合二倍體。   體細(xì)胞交換：是指雜合二倍體核在有絲分裂過程中的交換現(xiàn)象，染色體之間發(fā)生交換而產(chǎn)生部分標(biāo)記。（頻率0.001）    單倍化：指雜合二倍體細(xì)胞在增殖過程中，基因借助整條染色體的隨機(jī)交換而得到單倍重組體或單倍的親本分離子。（頻率0.01）

        （三）霉菌雜交技術(shù)

        （1）選擇親本；（2）強(qiáng)制異合；（3）移單菌落；（4）穩(wěn)定性檢驗(yàn)（雜合二倍體穩(wěn)定，而異核體不穩(wěn)定）；（5）促進(jìn)變異（紫外線處理……）。

        說明：雜合二倍體常常在異核體菌落上以角變或斑點(diǎn)形態(tài)出現(xiàn)，用接種針挑取其分生孢子，則可分離、純化得到雜合二倍體。（移單菌落）

        三、酵母菌的有性雜交

        （一）有性雜交：指性細(xì)胞間的接合和隨之發(fā)生的染色體重組，并產(chǎn)生新遺傳型的一種育種技術(shù)。

        雌雄菌株→有性接合→染色體重組→新遺傳型

        （二）酵母有性雜交育種的基本過程

        1、親株的選擇：具有親合性和遺傳標(biāo)記，考慮育種的目的性；

        2、形成子囊孢子（用產(chǎn)孢培養(yǎng)基）

        3、接合：酶法或機(jī)械法破碎子囊，釋放孢子，再平板涂布培養(yǎng)得到單倍體細(xì)胞，然后將兩個(gè)親本的單倍體細(xì)胞密集在一起，就可能的發(fā)生接合獲得各種類型雜合子

        4、雜交二倍體的篩選，從不同的雜合子中篩選初優(yōu)良性狀的個(gè)體。

        酵母的雙倍體與單倍體差異大

        雙倍體         單倍體

        細(xì)胞            大，橢圓形                    小，球形

        菌落            大，形態(tài)均一          小，形態(tài)變化較多

        液體培養(yǎng)     繁殖較快、細(xì)胞較分散          繁殖較慢，細(xì)胞常聚集成團(tuán)

        在產(chǎn)孢培養(yǎng)基上   能形成子囊                  不能形成子囊

        問：為什么有性雜交親本可以不做標(biāo)記，而準(zhǔn)性雜交親本需要做標(biāo)記？

        1、有性雜交頻率比準(zhǔn)性雜交頻率高。

        2、有性雜交親本一、親本二與重組體的細(xì)胞、菌落形態(tài)都不一樣。[原核微生物雜交親本也做標(biāo)記]

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